一、原理

疏水层析是一种根据分子表面疏水性不同来分离纯化生物大分子的方法，具有“高盐上样、低盐洗脱”的特点，疏水填料的疏水配基和蛋白质分子疏水性基团的表面都有一层水分子有序排列的水化膜，当溶液处于高盐浓度时，水化膜被破坏，蛋白质疏水基团暴露增多，疏水填料的疏水配基与蛋白质分子之间的疏水作用增加，从而结合目标蛋白。降低盐浓度后，疏水填料的疏水配基和蛋白质分子表面的逐步形成水化膜，两者之间的疏水作用减弱，从而洗脱蛋白。

二、填料的选择

由于各种生物大分子的疏水性和疏水基团存在不同，与不同疏水配基、不同疏水配基密度的填料之间的相互作用也不同，选择合适的层析条件可以将不同的分子分离。

1、配基的选择：配基的选择取决于目标蛋白的特性，包括其分子量、等电点、极性等。在选择配基时，一般考虑碳链长度、极性、空间结构等因素。常用的配基包括丁基、苯基、辛基等，这些基团在碳链长度和极性方面存在差异，苯环数量越多或碳链越长，填料的疏水性越强。丁基具有较低的表面能，适用于分离低极性和非极性蛋白；辛基具有较高的表面能，适用于分离高极性和亲水性蛋白。

2、疏水填料类型的选择：常用的疏水填料有不同的基球材质、交联方式、粒径、孔径等，使用时可根据实际情况进行选择。通常情况下，工业纯化捕获阶段推荐选择高流速、高刚性、大孔径的琼脂糖微球，到了精纯阶段，可考虑选择粒径更小的微球以提高分辨率。

三、使用过程

  疏水填料的使用过程主要包括以下步骤：

1、平衡与上样：磷酸盐-硫酸铵溶液是最常用的疏水层析盐溶液体系，也可以根据盐析原理选择其他盐，一般采取“高盐上样、低盐洗脱”的模式。

2、洗脱：可用恒定洗脱、梯度洗脱或者阶跃洗脱，一般推荐降低盐浓度的梯度洗脱进行。亦可根据实际情况，添加有机溶剂进行洗脱。

3、再生：用蒸馏水按操作流速冲洗，接着用平衡液冲洗。若有失活蛋白质或脂类物质在再生时洗不掉，可用在位清洗除去。

4、在位清洗：可有效去除介质上的杂质，反向效果更佳。

四、优点

1、活性回收率高。用中性或接近中性的盐水缓冲液作为流动相，使得在酸性及有机溶剂条件下容易失活的蛋白质，能以活性状态在疏水填料上进行分离。

2、采用含盐缓冲液作为流动相，可以在相似条件下进行许多需要保持生物活性的蛋白质的理化性质研究。

3、流动相成本低，大大减少了反相层析中使用的有机溶剂对环境的污染。

五、注意事项

1、不同配基的疏水填料与蛋白的结合能力不同，在进行疏水层析时要对不同的疏水填料进行筛选对比。

2、同一配基的疏水填料由于配基密度不同，其和蛋白的的疏水作用力也不同，选择填料时也要对不同配基密度的疏水填料进行筛选对比。

3、蛋白在高盐浓度下可能发生沉淀，在选择盐溶液之前，应先评估蛋白质复合物在溶液中的溶解性。

4、蛋白随温度的增加，其疏水基团充分暴露，和疏水介质的作用力变大，疏水层析过程要注意温度的影响。