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镍-琼脂糖凝胶FF以琼脂糖微球为基质，通过活化偶联亚氨基二乙酸（IDA），再螯合Ni²⁺。其中IDA是金属螯合层析中最常用的配体，与次氮基三乙酸（NTA）相比，具有亲和力强，载量高，可再生重复使用的特点。

镍-琼脂糖凝胶FF主要用于纯化带组氨酸标签（His-Tag）的重组蛋白。纯化原理是利用重组蛋白组氨酸标签的咪唑环可与过渡金属Ni²⁺形成稳定的配位键，因此能特异、牢固、可逆地吸附于固定这些金属离子的基质，结合了His-Tag重组蛋白的镍-琼脂糖凝胶FF一般通过增加咪唑浓度进行竞争洗脱。

技术指标：

使用方法：

1.色谱柱装填

以下阐述与层析系统连接时，填料的色谱柱装填方法。

1.1所有需要用到的材料的温度要与色谱操作的温度一样，液体最好做脱气处理。

1.2填料用量计算：通过沉降定量填料体积，需要的沉降填料体积=柱体积×压缩比（也称压缩因子）。沉降体积是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完全读取的稳定体积。IDA NUPharose FF的压缩比为1.15。为使达到装柱比，可通过柱头下压的方法，也可以通过高流速压柱。

1.3填料清洗：将填料悬液充分摇匀后量取相应体积，抽滤除去液体，并用约3倍填料体积的纯化水洗涤，重复3次，以除去保存液。

1.4装柱填料悬液准备：将填料转移到适当的容器中，加入适量的装柱液，制成50~75 v%的装柱填料悬液，使用前搅匀。

1.5装填前准备：在清洗干净的层析柱下端加入装柱液，以除去下垫片及层析柱下端的空气，在柱内保留少量的蒸馏水，拧紧下堵头，调整柱子使其垂直于地面。

1.6装填：将搅匀后的填料悬液一次性缓慢倒入层析柱内（必要时使用装柱器），为避免引入气泡，应使之沿层析柱内壁自然流下。将所有填料加入后，用装柱液将装柱器加满，拧紧装柱器上盖，将柱子与层析系统连接。

1.7压柱：使柱内填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完全后（填料与液体的界面清晰），去除装柱器，装上上柱头，并将柱头下降至界面处；通过高流速（推荐流速见下表，注意柱压不超过0.3 MPa），继续压柱至界面清晰稳定，标记界面稳定时的柱高。停泵，打开柱头上的阀门/堵头，关闭柱底的阀门/堵头，下压柱头至标记位置下方与压缩比对应的位置，旋紧柱头，装柱完成。装柱完成后，需用高流速平衡柱内的填料。

2.上样

2.1 样品一般溶解在pH6 ~ 8的初始缓冲液中，提高上样缓冲液的pH值，可以增大载量。

2.2 缓冲液中不能含有EDTA和柠檬酸盐，也最好不含巯基乙醇、DTT等还原剂。

2.3常用缓冲液有10 ~ 100 mM 磷酸钠缓冲液、20 ~ 200 mM Tris-HCl缓冲液等。

2.4在缓冲液中一般要加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl，以消除离子交换作用。

2.5在初次使用镍-琼脂糖凝胶FF，推荐使用50 mM PBS（50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，NaOH调节pH 7.4）作为初始缓冲液。

3. 洗脱

3.1 镍-琼脂糖凝胶FF最常用的洗脱方法为增加咪唑浓度进行洗脱。

3.2咪唑为碱性，相应缓冲液配制后需要用HCl进行调节pH。

3.3在初次使用镍-琼脂糖凝胶FF，不知道洗脱的咪唑浓度，推荐在初始缓冲液中分别加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑，浓度从低到高，分别洗脱和收集，通过SDS-PAGE电泳等方法鉴定。

3.4 有条件的也可以进行线性咪唑梯度洗脱，确定较佳洗脱条件。

拓展应用：

1. 更换不同的螯合离子

1.1 IDA螯合的镍-琼脂糖凝胶FF可以用EDTA脱掉镍，脱掉镍后可以用0.1 ~ 1.0M NaOH进行清洗凝胶，再重新螯合镍，使凝胶焕然一新。也可以螯合其他金属离子，如Cu²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Fe³⁺等，进行多样纯化。

1.2 脱镍方法：用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗柱子，再用5 ~ 10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子，再用2 ~ 3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。

1.3螯合金属离子方法：用2 ~ 5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍的柱子，用0.1 ~ 0.3M金属盐溶液过柱5 ~ 10个柱体积螯合金属，螯合后用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗，去除未螯合的金属离子。

1.4 金属盐可以为硫酸盐或盐酸盐，如为NiSO₄、CuSO₄、ZnSO₄、CoCl₂、PbSO₄等，金属盐溶液应中性或弱酸性，且必须经过过滤，以防止金属盐在胶上沉淀。

1.5 如果是Fe³⁺必须在低pH下螯合（pH 3），以防止Fe³⁺产生沉淀，一般可以加入少量盐酸和硫酸保持pH。

2. 多种洗脱方法

2.1 降低pH洗脱：大多数蛋白在pH 4 ~ 6会被洗脱下来，也可以在pH 3 ~ 4，缓冲液可以是醋酸钠、柠檬酸或磷酸盐缓冲体系。

2.2 竞争性洗脱：线性增加或一步增加与金属离子有亲和力的物质，如0 ~ 0.5 M咪唑，0 ~ 50 mM组氨酸，0 ~ 2 M NH₄Cl。梯度洗脱最好在起始缓冲液的恒定pH下进行。

2.3 螯合剂洗脱：EDTA、EGTA等螯合剂会与金属离子产生作用力，导致蛋白被洗脱下来。这种方法不能使不同的蛋白分离，此外会影响蛋白吸附，导致融合蛋白不能挂柱。

2.4 所有上述情况中，缓冲液中必须加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl 以消除离子交换作用。

2.5 当螯合离子配基是Cu²⁺时，有以下的三种操作方式。

降低pH洗脱：

上样缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，pH 7.4

洗脱缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，pH 3.5

竞争性洗脱：

上样缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，1 M NaCl，pH 7.4

洗脱缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，1 M NH₄Cl，pH 7.4

螯合剂洗脱：

上样缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，pH 7.4

洗脱缓冲液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4

注：配制的缓冲液需要用NaOH或HCl调节至要求的pH。使用降低pH和螯合剂洗脱会使金属离子脱落，下次使用得重新螯和金属离子，最常用的为竞争性洗脱。

再生、清洗：

1. 凝胶的再生

1.1 多次使用后或需要更换螯合的金属离子，必须将胶脱镍再生。脱镍方法：用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗柱子，再用5 ~ 10个柱体积的100 mM EDTA淋洗柱子，再用2 ~ 3个柱体积的0.5 M NaCl洗掉残留的EDTA。

1.2 多次使用的柱子脱镍后一般需要清洗。清洗方法：用0.1 ~ 1.0 M NaOH反向清洗柱子，流速50 cm/h，保持1 ~ 2 h，能去除结合强的杂质，同时也能去除热源。

1.3 清洗后需要重新螯合金属离子。螯合方法：用2 ~ 5个柱体积的蒸馏水充分平衡脱镍的柱子，用0.1 ~ 0.3M金属盐溶液过柱5 ~ 10个柱体积螯合金属，螯合后用5 ~ 10个柱体积蒸馏水淋洗，去除未螯合的金属离子。

2.在位清洗

2.1 除去因离子交换作用吸附的蛋白，用2 ~ 3个柱体积2 M 的NaCl溶液反向清洗柱子。

2.2 除去强的疏水性蛋白和脂质等，用4个柱体积的70%的乙醇或者30%的异丙醇反向清洗柱子。

2.3 除去蛋白沉淀、疏水性蛋白，参照凝胶的再生。

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